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行業新聞

HPV檢測國內公司技術總結

2019/05/13

導讀:

及早發現和治療是宮頸癌防治的主要原則,因此,近些年國內企業開始在HPV檢測上發力。國家食品藥品監督管理總局 (CFDA) 官網最新數據顯示:目前已獲得CFDA醫療器械注冊證的HPV分子診斷試劑已有近百種,涉及43家企業。海外代表性企業有凱杰、豪洛捷和羅氏等;國內近年也呈蓬勃發展之勢,以凱普、金域、達安、亞能、港龍、之江、華大等為代表。HPV檢測涉及的具體方法也有多種類型,常見的有雜交捕獲法、膜雜交法、熒光PCR法、mRNA檢測法等 (各種HPV檢測方法的比較詳見下圖)。其中,有四種方法已獲FDA批準,分別為第二代雜交捕獲法 (HC2,凱杰)、熒光PCR法 (Cobas,羅氏)、酶切信號放大法 (Cervista,豪洛捷)、mRNA檢測法 (Aptima,豪洛捷)。



篩查是指在癌癥出現明顯癥狀前通過某些方法去發現它,通過篩查可以發現早期的癌癥、甚至癌前病變。宮頸癌的篩查包括宮頸細胞學檢測及人類乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測。細胞學檢測包括巴氏涂片和TCT液基細胞壓片。TCT相較于巴氏涂片更易于發現異常細胞,敏感性較高,但價格相對較高。HPV DNA檢測相比細胞學檢測的靈敏度更高,而且能夠對高危型和低危型進行分型和定量檢測,是目前宮頸癌早期診斷主要發展方向之一。一旦細胞學或者DNA病毒篩查發現異常,可進一步實施陰道鏡和組織活檢,并開展進一步治療。

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                                                                                         HPV分子診斷技術詳解
1、qPCR

qPCR, (Real-time Quantitative PCR,即實時熒光定量PCR),是PCR的第三代技術。該技術通過在擴增時向擴增產物做個熒光標記,隨著產物的增加,熒光信號增強,通過實時檢測熒光信號就能得到擴增的DNA數量。熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料,主要有TaqMan探針(以美國ABI公司為代表)和FRET技術(以羅氏公司為代表)和SYBR Green I,EvaGreen、LC Green熒光染料等。我手上有一份TermoFisher出的實時熒光定量 PCR 手冊,可關注后回復“實時熒光定量 PCR 基礎知識”下載領取。
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                                 qPCR原理之一


2、PCR-反向點雜交

PCR-反向點雜交,也稱反向斑點雜交。PCR-反向點雜交即將生物素標記的特異性PCR擴增產物與固定于膜上的探針雜交顯色,進行基因分型、基因突變的檢測。這種方法最大的特點是結合PCR進行核酸分子擴增,通過在不同位置固定數十甚至數百種等位基因,只需要1次雜交,就可以實現多種等位基因的篩查。是DNA印跡技術的進化版本。

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                                                  反向斑點雜交原理

3、基因芯片

基因芯片本質上也是依靠DNA分子的雜交,其與反向斑點雜交有著異曲同工之處?;蛐酒诨椎倪x擇上更廣,固定探針數量也更多,其加工也更依賴于微加工技術,因此稱為基因芯片。個人認為,基因芯片會是DNA印跡技術最主要發展方向。

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                                                       基因芯片

4、流式熒光雜交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)

該技術源于熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)。FISH是利用標記的DNA探針,在細胞內部與DNA進行原位雜交,并用熒光的方式作為信號讀出。流式熒光雜交法是將熒光標記的細胞通過流式細胞儀進行快速的分析檢測。該方法最大的好處是編碼方便,可實現多種亞型DNA的檢測,自動化程度相對于膜條法更高。

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                                             FISH原理

5、恒溫擴增-熒光法

與PCR不同,恒溫擴增其反應過程始終維持在恒定溫度下,通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速核酸擴增的目的。其中的技術原理很多,如LAMP、RPA和RCA等,環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是應用最多的技術。該技術反應快,操作簡便,且具備肉眼讀出的特點,目前主要用于POCT等快檢領域。該方法還會持續在DNA的快速檢測等方面具有更廣闊的應用。關于LAMP的詳細介紹,可關注后回復“LAMP技術”下載。

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                                                                                     LAMP原理

6、HC2-HPV-DNA

HC2即二代雜交捕獲。相對于一代雜交,HC2和ELISA有異曲同工之處。首先把樣品中的細胞失活,釋放DNA分子。釋放的DNA與HPV 的RNA探針結合,并被單克隆抗體捕獲。加入偶聯了HRP的二抗,通過HRP催化的化學發光進行最后的信號讀出。該技術由美國馬里蘭州的分子診斷公司Digene研發,由于不需要擴增,取樣簡單,污染小,可一次性檢出13種高危HPV亞型,具有很高的應用價值。關于該法的具體視頻介紹,可關注后回復“HC2-HPV-DNA視頻”下載。

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                                                           HC2-HPV-DNA

7、PCR毛細管電泳法、雜交捕獲化學發光法和測序法

PCR毛細管電泳法就是利用毛細管電泳來對PCR的產物進行分析。該方法最大的缺點是無法對DNA進行分型檢測。雜交捕獲化學發光法相對于斑點雜交在于最后的信號讀出由熒光信號轉變為化學發光。測序法是利用測序儀器對DNA進行測序,目前國內主要由華大基因主導。

目前在國家藥品監督管理局注冊的HPV檢測大多基于這些技術,其中熒光PCR法是報道最多的方法,占據了主導地位。通過關鍵詞“人乳頭瘤病毒”在國家藥品監督管理局搜索得到2014年以后批準的有91個,其中熒光PCR有67個,反向雜交有7個,基因芯片、流式熒光雜交和恒溫擴增的各有4家,其余方法很少采用。詳細列表可關注后回復“已獲批準HPV檢測試劑盒”下載。


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                                                           國內HPV檢測技術分類占比情況

數據來源:國家藥品監督管理局。關鍵詞:人乳頭瘤病毒,國產器械。

數據統計包未包含2014年以前注冊。

技術原理類別

注冊數量

雜交捕獲-化學發光法

1

測序法

1

表面等離子諧振法

1

PCR毛細管電泳法

2

恒溫擴增-熒光法

4

流式熒光雜交法

4

基因芯片法

4

PCR-反向點雜交法

7

熒光PCR法

67

總計

91

國內公司HPV試劑盒注冊匯總

公司名稱/技術原理

計數項:公司名稱

計數項:技術原理

港龍生物技術(深圳)有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

華大生物科技(武漢)有限公司

1

1

測序法

1

1

上??迫A生物工程股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

上海之江生物科技股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

艾康生物技術(杭州)有限公司

4

4

PCR-反向點雜交法

1

1

熒光PCR法

3

3

安徽同科生物科技有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

北京博暉創新光電技術股份有限公司

1

1

基因芯片法

1

1

北京華大吉比愛生物技術有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

北京金菩嘉醫療科技有限公司

1

1

表面等離子諧振法

1

1

北京康美天鴻生物科技有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

博奧生物集團有限公司

2

2

基因芯片法

1

1

熒光PCR法

1

1

潮州凱普生物化學有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

成都博奧晶芯生物科技有限公司

1

1

基因芯片法

1

1

東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

港龍生物技術(深圳)有限公司

2

2

基因芯片法

1

1

熒光PCR法

1

1

廣州安必平醫藥科技股份有限公司

2

2

PCR-反向點雜交法

1

1

熒光PCR法

1

1

廣州安必平醫藥科技有限公司

1

1

PCR-反向點雜交法

1

1

廣州和實生物技術有限公司

3

3

PCR-反向點雜交法

1

1

熒光PCR法

2

2

杭州迪安生物技術有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

湖南圣湘生物科技有限公司

3

3

熒光PCR法

3

3

江蘇默金生物工程技術有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

江蘇默樂生物科技股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

江蘇默樂生物科技有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

江蘇碩世生物科技有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

凱杰生物工程(深圳)有限公司

3

3

熒光PCR法

2

2

雜交捕獲-化學發光法

1

1

寧波海爾施基因科技有限公司

2

2

PCR毛細管電泳法

2

2

廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司

3

3

熒光PCR法

3

3

廈門安普利生物工程有限公司

3

3

熒光PCR法

3

3

廈門致善生物科技股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

上海復星長征醫學科學有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

上??迫A生物工程股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

上海普洛麥格生物產品有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

上海透景生命科技有限公司

6

6

流式熒光雜交法

4

4

熒光PCR法

2

2

上海之江生物科技股份有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

深圳康美生物科技股份有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

蘇州華益美生物科技有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

蘇州天隆生物科技有限公司

1

1

熒光PCR法

1

1

泰普生物科學(中國)有限公司

6

6

PCR-反向點雜交法

1

1

熒光PCR法

5

5

無錫市申瑞生物制品有限公司

2

2

熒光PCR法

2

2

武漢百泰基因工程有限公司

3

3

熒光PCR法

3

3

亞能生物技術(深圳)有限公司

4

4

PCR-反向點雜交法

2

2

熒光PCR法

2

2

中山大學達安基因股份有限公司

5

5

熒光PCR法

5

5

中生方政生物技術有限公司

6

6

恒溫擴增-熒光法

4

4

熒光PCR法

2

2

總計

91

91



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